Laborationsdag 4

 Vi fick inte så lång vandring i våran gel( dock hade vi låtit den stå i ca 45 minuter som absolut skulle ha varit tillräckligt för att den skulle vandrat så långt som det skulle) men man kan tydligt se produkterna av våran klyvning. Vi kunde avgöra att vi hade klyvt fram något som hade samma storlek som LL37, och kunde därför anta att det var LL37 eftersom vi visste att plasmiden innehöll LL37. Man ser tydligt banden i brunnen med 0,5 mikrogram men i den spädda till 0,005 mikrogram kan man inte se några band när man belyser gelen med UV-ljus och fotografterar.



Mina funderingar är i kring hur det kom sig att det inte vandrade längre i gelen...Tyckte att det rann ut riktigt bra i tråget och såg inga luftbubblor eller något sådant. Så jag har ingen riktig förklaring till varför. Har någon nåt förslag på vad det kan ha berott på?


På nylonmembranet efter Southern Blot kunde man då se två band i 0,005 mikrograms brunnen som var ungefär lika med de som finns i 0,5 mikrograms brunnen. Det betyder att Southern Blot är mer sensitiv. Den påvisar resultat vid mindre mängder vilket är en fördel med Southern Blot. En stor nackdel dock är att den tar så långt tid att utföra. PCR tar kortare tid vilket är dess fördel men nackdelen är då att inte lika små mängder kan detekteras i gelen.
PCR kändes okompliserad i jämförelse med Southern. Mindre arbete att utföra vilket ger att det fanns färre saker som kunde gå fel. Och om man skulle missa t.ex en forward eller reverse primer i MasterMixen så kan man snabbt göra en ny efter att man upptäckt sitt misstag efter UV-bestrålningen och ingen produkt visats. Om Southern Blot misslyckas finns det fler orsaker till detta än det finns till om PCRen misslyckas. Dessutom så är ju då tidsaspekten en riktig nackdel, eftersom Sothern Blot tar så lång tid att genomföra förlorar man mycket tid om det blir fel.

Det viktigaste jag har lärt mig under laborationen är noggranhet som krävs i yrket och hur man uppnår den. Det som jag har som exempel är inmärkningen av proben. Hur man lyckades trots att man inte såg pelleten.
En annan sak jag lärt mig är att våga, jag var lite rädd för att pipettera ner i brunnarna på gelen i elektroforesen för att andra hade pratat om hur svårt det var. Det är bättre att prov själv innan man drar slutsatser.

Laborationsdag 2

Våran elektrofores ser bra ut, vi har fått ett starkt band och det betyder massa av mollekyler. PCR amplifieringen har fungerat.
Vid kontrollelektroforesen så hade vi både en negativ och positiv kontroll som gör att vi kan lita på resultatet. Den negativa kontrollen gav inget band på gelen, vilket den inte skulle heller vilket betydde att det inte skett någon carry-over kontamination och inte heller gett något PCR amplifikat. Den positiva kontrollen gav ett väldigt tydligt band, vilket den skulle eftersom den positiva kontrollen innehöll känd LL37 gen. Den positiva kontrollen visade att PCR amplifieringen fungerat och även att MasterMixen har fungerat. Dock var bandet väldigt starkt och det hade bildats en smear, detta för att det var för hög koncentration på den positiva kontroll-lösningen. Smearen berodde på att pga den höga koncentrationen så hann inte allt gå igenom gelen innan vi avslutade och fotografterade gelen.  Markörerna hjälper oss också i att bestämma storleken på vårat PCR-amplifikat. Så att vi ser att vi fått rätt PCR-amplifikat.

Bildförklaring: brunn 1= markör III, brunn 2= negativ kontroll, brunn 3= PCR amplifikat, brunn 4= positiv kontroll, brunn 5= markör IV, brunn 6= plasmid, brunn 7= markör IX. 
En fundering gällande vårt PCR amplifikat är att vårat band blev väldigt starkt, inte så starkt så att det blev en smear men ändock. Vi hade ju två olika koncentrationer på våran plasmid prep lösning eftersom vi gjorde två stycken spektrofotometrier. Vi diskuterade och kom fram till att använda den med lägst renhetskvot för att vara på den säkra sidan så att det inte blev för lite material till PCR amplifikationen. Så här i efterhand ser vi på resultatet att det inte hade behövts. En fråga är hur ska man ställa sig till koncentrationen på plasmiden när vi hade så skilda resultat? Skulle vi ha tagit ett medelvärde?

Laborationsdag 1

Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.
Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Förhoppningsvis har vi tagit bort kromosomalt DNA och RNA och protein.

Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?
Vi mätte koncentrationen och renheten av plasmid DNA prep genom spektofotometri. Vi mätte absorbansen vid 260 nm för DNA och 280 nm för protein  Kvoten A260/A280 ger renheten på plasmidprepen gällande proteinförorening. Jag fick 0,075 A på DNA och 0,043 på protein absorbansen. Det ger en kvot på 1,74. Kvoten bör ligga mellan 1,8 och 1,9, om man som i mitt fall har lägre än 1,8 så påvisar det troligtvis på kontamination av protein.

Men nu var det så att pga sjukdom delade jag upp labben på båda dagarna. Min labpartner fortsatte på eftermiddagen och även han gjorde en spektrofotometri som fick helt andra värden än vad jag kom fram till dagen efter. Han fick 0,065 A på DNA och 0,030 A på protein vilket ger en kvot på 2,16 vilket istället skulle visa på en mycket ren plasmid från proteinföroreningar.

Mina funderingar är om detta är möjligt? Kan man ur samma plasmidprep-lösning få så stora skillnader? Har det ngt att göra med att den ena utfördes efter ett dygn av förvaring i kylskåp? Eller handlar det om  pipettering?

Så min fundering kring mitt resultat är om det är en ren plasmid eller en plasmid med en liten grad av proteinföroreningar.