Vid kontrollelektroforesen så hade vi både en negativ och positiv kontroll som gör att vi kan lita på resultatet. Den negativa kontrollen gav inget band på gelen, vilket den inte skulle heller vilket betydde att det inte skett någon carry-over kontamination och inte heller gett något PCR amplifikat. Den positiva kontrollen gav ett väldigt tydligt band, vilket den skulle eftersom den positiva kontrollen innehöll känd LL37 gen. Den positiva kontrollen visade att PCR amplifieringen fungerat och även att MasterMixen har fungerat. Dock var bandet väldigt starkt och det hade bildats en smear, detta för att det var för hög koncentration på den positiva kontroll-lösningen. Smearen berodde på att pga den höga koncentrationen så hann inte allt gå igenom gelen innan vi avslutade och fotografterade gelen. Markörerna hjälper oss också i att bestämma storleken på vårat PCR-amplifikat. Så att vi ser att vi fått rätt PCR-amplifikat.
Bildförklaring: brunn 1= markör III, brunn 2= negativ kontroll, brunn 3= PCR amplifikat, brunn 4= positiv kontroll, brunn 5= markör IV, brunn 6= plasmid, brunn 7= markör IX.
En fundering gällande vårt PCR amplifikat är att vårat band blev väldigt starkt, inte så starkt så att det blev en smear men ändock. Vi hade ju två olika koncentrationer på våran plasmid prep lösning eftersom vi gjorde två stycken spektrofotometrier. Vi diskuterade och kom fram till att använda den med lägst renhetskvot för att vara på den säkra sidan så att det inte blev för lite material till PCR amplifikationen. Så här i efterhand ser vi på resultatet att det inte hade behövts. En fråga är hur ska man ställa sig till koncentrationen på plasmiden när vi hade så skilda resultat? Skulle vi ha tagit ett medelvärde?
Hej Sophie,
SvaraRaderavad är "renhetskvot"? Det låter som om det är ett mått på renhet??
Märit
Hej!
SvaraRaderaHär tycker jag att det skulle vara ytterst viktigt om du hade haft med bilden. Detta för att lättare kunna kommentera och följa dina tolkningar.
Annars har du hållt dig till frågan. Angående den okluvna spalten, vad har den för funktion eller vad visar den? Markörerna, hur såg de ut jämt emot dina resultat?
Angående din fråga om kocentration på plasmid. menar du den vi räknade ut i under första laborations dagen? i så fall tycker jag att ni borde använt de svaret som tillhörde det första försöket.
Bra jobbat! :)
/ Carolina Larsen
Svar till Märit: renhetskvoten är ett mått på hur rent DNA/RNA är från protein. Vi vet fortfarande inte om vi har endast det DNA vi vill ha eftersom vi inte har kollat efter andra föroreningar så som RNA eller kromosomalt DNA.
SvaraRaderaTill Carolina : Bilden finns nu med, precis som det var tänkt från början, det blev bara lite krångel med scanningen.
SvaraRaderaHej hej!
SvaraRaderaJag tror att anledningen till att Märit frågade var att ordet "renhetskvot" är väldigt vilseledande då det inte säger nånting om VAD provet är renat ifrån, och att man kanske borde uttrycka sig annorlunda.
Det var bra att du diskuterade den negativa kontrollen och varför det uppkommit en smear på den positiva kontrollen, men jag saknar lite diskussion kring övriga resultat så som Carolina säger.
//Camilla