Mina funderingar är i kring hur det kom sig att det inte vandrade längre i gelen...Tyckte att det rann ut riktigt bra i tråget och såg inga luftbubblor eller något sådant. Så jag har ingen riktig förklaring till varför. Har någon nåt förslag på vad det kan ha berott på?På nylonmembranet efter Southern Blot kunde man då se två band i 0,005 mikrograms brunnen som var ungefär lika med de som finns i 0,5 mikrograms brunnen. Det betyder att Southern Blot är mer sensitiv. Den påvisar resultat vid mindre mängder vilket är en fördel med Southern Blot. En stor nackdel dock är att den tar så långt tid att utföra. PCR tar kortare tid vilket är dess fördel men nackdelen är då att inte lika små mängder kan detekteras i gelen.
PCR kändes okompliserad i jämförelse med Southern. Mindre arbete att utföra vilket ger att det fanns färre saker som kunde gå fel. Och om man skulle missa t.ex en forward eller reverse primer i MasterMixen så kan man snabbt göra en ny efter att man upptäckt sitt misstag efter UV-bestrålningen och ingen produkt visats. Om Southern Blot misslyckas finns det fler orsaker till detta än det finns till om PCRen misslyckas. Dessutom så är ju då tidsaspekten en riktig nackdel, eftersom Sothern Blot tar så lång tid att genomföra förlorar man mycket tid om det blir fel.
Det viktigaste jag har lärt mig under laborationen är noggranhet som krävs i yrket och hur man uppnår den. Det som jag har som exempel är inmärkningen av proben. Hur man lyckades trots att man inte såg pelleten.
En annan sak jag lärt mig är att våga, jag var lite rädd för att pipettera ner i brunnarna på gelen i elektroforesen för att andra hade pratat om hur svårt det var. Det är bättre att prov själv innan man drar slutsatser.
Hej Sophie,
SvaraRaderaså här kan det bli på en undervisningslab, du skriver: "...kunde därför anta att det var LL37 eftersom vi visste att plasmiden innehöll LL37".
Men vitsen med projektet var att ni skulle bevisa att plasmiden innehöll LL37, och då räcker det inte att visa att insertet har ungefär samma storlek som genen. Det var ju därför vi bl a utförde Southern blot. Du borde ha diskuterat resultatet av Southern, visade det att insertet var LL37 på ett säkrare sätt än att bara se att insertet var av förväntad storlek?
Att Southern blot är mer sensitiv (än PCR menar du väl?) är kanske lätt att tro eftersom ni hade större mängd plasmid vid PCR. Men eftersom vi inte testat samma mängder vid de två metoderna, kan vi faktiskt inte säga något om vem som är mest känslig.
"....ingen produkt visats". Jag hoppas att du menar i den positiva kontrollen. Om ingen produkt visats i ditt prov, kan det ju bero på att din genen du vill amplifiera inte fanns i provet. Det är ju verkligheten när man gör en PCR, man vet inte om genen finns, utan PCR är ett sätt att ta reda på det.
Roligt att läsa vad du har lärt dig, hoppas du har nytta av detta i fortsättningen! Jag tror också att du tränat ditt omdöme så du kan avgöra NÄR det är viktigt att vara extra noggrann.
Märit
Hej
SvaraRaderaDu har haft en lätt diskussion mellan de 2 olika metoderna vilket är bra.
Bra att du hade med de båda fotografierna så att man lättare kan jämföra dessa och tolka resultatet.
Jag håller med dig om att den här laborationen har varit lärorik på många vis. Speciellt då man ska pipettera ner i de olika brunnarna. Det är nog många som håller med om det.
/ Carolina Larsen
God afton :)
SvaraRadera45 minuter lät länge (nu vet jag förstås inte hur länge vår elektrofores fick fortgå); jag undrar också vad som kan vara orsaken till att molekylerna inte vandrade så långt. Hmm. Jag antar att ni hade rätt spänning? Och det kan väl inte vara att det är en tätare gel, för ni använde väl samma gel som förra gången? Hmm.
Jag håller nog med Märit om att du kanske borde ha diskuterat mer kring hur man faktiskt kan dra slutsatsen att ni faktiskt har LL37 i ert prov.
Bra jobbat, Sophie! :)
//Camilla