onsdag 14 september 2011
Laborationsdag 1
Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.
Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Förhoppningsvis har vi tagit bort kromosomalt DNA och RNA och protein.
Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?
Vi mätte koncentrationen och renheten av plasmid DNA prep genom spektofotometri. Vi mätte absorbansen vid 260 nm för DNA och 280 nm för protein Kvoten A260/A280 ger renheten på plasmidprepen gällande proteinförorening. Jag fick 0,075 A på DNA och 0,043 på protein absorbansen. Det ger en kvot på 1,74. Kvoten bör ligga mellan 1,8 och 1,9, om man som i mitt fall har lägre än 1,8 så påvisar det troligtvis på kontamination av protein.
Men nu var det så att pga sjukdom delade jag upp labben på båda dagarna. Min labpartner fortsatte på eftermiddagen och även han gjorde en spektrofotometri som fick helt andra värden än vad jag kom fram till dagen efter. Han fick 0,065 A på DNA och 0,030 A på protein vilket ger en kvot på 2,16 vilket istället skulle visa på en mycket ren plasmid från proteinföroreningar.
Mina funderingar är om detta är möjligt? Kan man ur samma plasmidprep-lösning få så stora skillnader? Har det ngt att göra med att den ena utfördes efter ett dygn av förvaring i kylskåp? Eller handlar det om pipettering?
Så min fundering kring mitt resultat är om det är en ren plasmid eller en plasmid med en liten grad av proteinföroreningar.
Prenumerera på:
Kommentarer till inlägget (Atom)
Hej Sophie,
SvaraRaderaintressant! Vi har tidigare märkt att vår absorbansmätningsmetod inte har så hög repeterbarhet. Jag vet inte orsaken, men tror inte att det har något med pipettering att göra. I så fall skulle ju förhållandet mellan de två absorbansvärdena inte variera. Jag har sett ett pek som handlar om att plaströr kan läcka kemikalier som påverkar absorbansen vid dessa våglängder, det är möjligt att det kan vara en del av förklaringen.
Vad tycker ni som skall kommentera bloggen, har Sophie proteinförorening i sin plasmid eller inte?
Hej!
SvaraRaderaBra jobbat med bloggen Sophie. Dina svar framgår tydligt.intressant att det kunde skilja så mycket ändå. Det skulle varit trevligt med en bild och om du kanske funderat lite mer kring kurvan. Vad som kan påverka den? Men jag förstår att du har haft fullt upp med att tänka över ditt resultat.
Jag tycker själv att det är en klurig fråga. Men kan spektrofotometerna ha något med det att göra? om det har använts olika till de olika mätningarna? Du kanske skulle ha gjort ett extra test och sätt ifall resultatet ytterligare förändrats något?
/ Carolina Larsen
Hmm, jag är inte helt säker, men jag har för mig att Mörit sa på labbuppföljningen (tror jag det var) att även ett värde mellan 1,7 och 1,8 kan vara helt okej och att det först är om värdet understiger 1,7 som man bör haja till på riktigt. Därför skulle i alla fall jag säga att ert resultat bör vara okej.
SvaraRaderaJa, det var väl allt jag hade att säga. :)
//Camilla
... och med "Mörit" menade jag naturligtvis "Märit".
SvaraRadera